كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء (HPLC): المبدأ، المكونات، التطبيقات

ما هي تقنية HPLC؟

HPLC، أو كروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ، هي تقنية تحليلية قوية تستخدم لفصل وتنقية الخلائط المعقدة من المركبات.

مبدأ العمل

المبدأ في هذا الجهاز، هو أنه يعمل عن طريق إجبار عينة سائلة، تسمى الطور المتحرك، على مرحلة ثابتة، والتي يمكن أن تكون صلبة أو سائلة. يتم بعد ذلك فصل المركبات الموجودة في العينة بناءً على تفاعلاتها مع المرحلة الثابتة 'الطور الثابت'، مما يسمح بعزل مركبات معينة.

الطور المتحرك

تتحكم ترتيب الإلوتيون للمذيبات في HPLC بالقطبية. في فصل الطور العادي، تقضي المذيبات ذات القطبية الأقل وقتًا نسبيًا في المرحلة الثابتة القطبية وهي أول المذيبات التي تخرج من العمود. وبالنسبة للطور العكسي، فإن ترتيب الإلوتيون هو عكس ذلك في فصل المرحلة العادية، حيث تخرج المذيبات ذات القطبية الأعلى أولاً. وتؤدي زيادة قطبية المرحلة المتحركة إلى زيادة أوقات الاحتفاظ. وتتطلب أوقات الاحتفاظ الأقصر مرحلة متحركة ذات قطبية أقل.

هناك عدة مؤشرات تساعد في اختيار مرحلة متحركة، ومن بينها مؤشر القطبية. توفر جداول القطبية قيمًا لمؤشر القطبية، P′، لعدة مراحل متحركة شائعة، حيث تتوافق القيم الأكبر لـ P′ مع المذيبات ذات القطبية الأعلى. يؤدي خلط مرحلتين أو أكثر من المراحل المتحركة، بشرط أن تكون قابلة للامتزاج، إلى إنشاء مرحلة متحركة ذات قطبية وسط. على سبيل المثال، يتم إنشاء مرحلة متحركة ثنائية بدمج المذيبات A و B، ولها مؤشر قطبية \(P′_{AB}\) يساوي
\[P′_{AB} = Φ_AP′_A + Φ_BP′_B\]
حيث تمثل \(P′_A\) و \(P′_B\) مؤشرات القطبية للمذيبات A و B على التوالي، وتمثل \(Φ_A\) و \(Φ_B\) كسور حجم المذيبات الاثنين[1]. الطور المتحرك نموذجيًا عبارة عن خليط من الماء ومذيب مثل الميثانول أو الأسيتونتريل أو تتراهيدروفيوران[1][2].

أنواع كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء (الطور الثابت)

هناك عدة أنواع مختلفة من HPLC، تم تقسيم هذه الأنواع بناء على الطور الثابت.

يتميز النوع ذو الطور العادي بالطبيعة القطبية، وهو محب للماء، حيث يستخدم مع طور متحرك غير قطبي.
HPLC ذو الطور العكسي هو الطريقة الأكثر استخدامًا ويستند إلى الطبيعة غير القطبية للمرحلة الثابتة.
يتم استخدام كروماتوغرافيا التبادل الأيوني لفصل الجزيئات المشحونة.
بينما يتم استخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لفصل الجزيئات بناءً على حجمها.

ما هي مكونات جهاز HPLC؟

يتكون جهاز HPLC (الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء) عادةً من المكونات التالية:

المضخة:

تُستخدم لإنشاء الضغط العالي اللازم لدفع السائل عبر العمود. مضخات HPLC (الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء) هي أجهزة تستخدم لضخ مذيب سائل عبر عمود لفصل وتنقية المكونات المختلفة للخليط. عادة ما يكون المذيب عبارة عن خليط من الماء ومذيب عضوي واحد أو أكثر ، ويحتوي العمود على طور ثابت يفصل بين مكونات الخليط بناءً على خواصها الكيميائية والفيزيائية. تستخدم مضخات HPLC بشكل شائع في البحوث والصناعة الكيميائية والصيدلانية والتكنولوجيا الحيوية.

حاقن العينة:

يستخدم لإدخال العينة في النظام. حاقن العينة ، المعروف أيضًا باسم حلقة العينة أو صمام العينة (Sample Valve)، هو جهاز يستخدم لإدخال كمية صغيرة من العينة في نظام HPLC (الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء). يوجد حاقن العينة عادةً في مقدمة نظام HPLC ومتصل بمضخة HPLC. يسمح بإدخال كمية دقيقة وقابلة للتكرار من العينة في نظام HPLC. هناك أنواع مختلفة من حاقنات العينات المتاحة ، مثل حاقنات الحلقة اليدوية ، والحاقنات الأوتوماتيكية ، والحاقنات القائمة على الصمام. يعتمد نوع الحاقن المستخدم على التطبيق المحدد وحجم العينة المطلوب.

العمود:

حيث يحدث الفصل الفعلي للمكونات في العينة.

عمود الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء HPLC عبارة عن جهاز يفصل بين مكونات الخليط بناءً على خواصها الكيميائية والفيزيائية. يتم استخدامه مع مضخة HPLC لضخ مذيب سائل عبر العمود. في السابق كانت تستخدم الأعمدة المصنوعة من الزجاج العادي، لكن في الآونة الحديثة تستخدم مواد أكثر كفاءة مثل زجاج البورسليكات وزجاج الاكريليك والفولاز المقاوم للصدأ[3].

يحتوي العمود على مرحلة ثابتة ، والتي يمكن أن تكون صلبة أو سائلة ، ومعبأة بحبيبات أو جزيئات صغيرة ذات مساحة سطح عالية. يتم اختيار المرحلة الثابتة بناءً على خصائص مكونات الخليط التي يتم فصلها ، مثل قطبيتها ووزنها الجزيئي. ويستخدم بشكل شائع السليكا جل بسبب حجم حبيباته المناسب والمسامية العالية، بالإضافة إلى أنه خامل لا يتفاعل مع الطور المتحرك[4].

تتوفر أنواع مختلفة من أعمدة HPLC ، مثل أعمدة الطور العكسي وأعمدة الطور العادي وأعمدة التبادل الأيوني. يعتمد اختيار العمود على التطبيق المحدد وخصائص المركبات التي يتم فصلها.

الكاشف:

يستخدم لاكتشاف المكونات الفردية عند خروجها من العمود. كاشف HPLC، هو جهاز يكتشف ويقيس وجود مركبات معينة في المذيب المذاب بعد مروره عبر العمود. يولد الكاشف إشارة تتناسب مع تركيز المركب في العينة. تتوفر أنواع مختلفة من الكواشف ل HPLC ، مثل:

1. كاشف UV-Vis:

يكتشف المركبات بناءً على امتصاصها للأشعة فوق البنفسجية أو الضوء المرئي. يستخدم على نطاق واسع للكشف عن المركبات العضوية.

2. كاشف التألق:

يكتشف المركبات بناءً على انبعاثها من التألق عندما يتم تحفيزها بواسطة طول موجي معين من الضوء. يستخدم على نطاق واسع للكشف عن المركبات العضوية وكذلك بعض المركبات غير العضوية

3. كاشف معامل الانكسار:

يكتشف المركبات بناءً على معامل الانكسار ، وهو مقياس لانحناء الضوء أثناء مروره عبر مادة ما. يستخدم على نطاق واسع للكشف عن المركبات غير العضوية.

4. كاشف مطياف الكتلة:

يكتشف المركبات بناءً على نسبة الكتلة إلى الشحنة. يستخدم على نطاق واسع للكشف عن التركيز المنخفض ، وتحديد المركبات غير المعروفة والتحليل الهيكلي.

✅ يعتمد اختيار الكاشف على التطبيق المحدد وخصائص المركبات التي يتم اكتشافها.

نظام الحصول على البيانات وتحليلها:

وحدة تحليل البيانات في HPLC هي أداة حاسوبية تستخدم لجمع وتحليل البيانات المتعلقة بالكاشف. تُستخدم هذه الوحدة لمعالجة وتفسير البيانات الناتجة عن الكاشف، والتي عادة ما تكون في شكل مخطط كروماتوجرافي، وهو مخطط لإشارة الكاشف كدالة للوقت. يمكن لوحدة تحليل البيانات أداء مجموعة متنوعة من المهام، مثل:

الحصول على البيانات:

يستخدم برنامج الحصول على البيانات لجمع البيانات الكروماتوغرافية من الكاشف وتخزينها في جهاز الكمبيوتر.

معالجة البيانات:

يتم استخدام برنامج معالجة البيانات لمعالجة البيانات الكروماتوغرافية ، مثل التنعيم أو التصحيح الأساسي ، من أجل تحسين جودة البيانات.

تحليل البيانات:

يستخدم برنامج تحليل البيانات لإجراء التحليل الكمي والتحليل النوعي للبيانات الكروماتوغرافية. قد يشمل ذلك تحديد الذروة ، وتكامل الذروة ، وحساب أوقات الاستبقاء.

الإبلاغ عن البيانات:

يتم استخدام برنامج الإبلاغ عن البيانات لإنشاء التقارير والتمثيلات الرسومية للبيانات الكروماتوغرافية ، مثل جداول الذروة والكروماتوجرام.

أرشفة البيانات:

يستخدم برنامج أرشفة البيانات لتخزين وإدارة البيانات الكروماتوغرافية بطريقة آمنة ومنظمة.

✅ يمكن توفير كل هذه الوظائف من خلال برنامج واحد أو بواسطة برامج متعددة ، كما أنها تعتمد على الشركة المصنعة للأداة والتطبيق المحدد.

قد تكون المكونات الإضافية للجهاز موجودة أيضًا اعتمادًا على التطبيق أو التصميم المحدد لنظام HPLC.

ما هي الاختلافات بين HPLC و UPLC

محل الإختلاف	جهاز HPLC	جهاز UPLC
حجم الجسيمات	في العادة يكون من 1.7~2.2 ميكرون	في العادة 5 ميكرون
الضغط	400 بار	600 بار
سرعة الفصل	سريع	أسرع
الأداء	عالية الكفاءة Height	فائقة الكفاءة Ultra
الدقة	عالية الدقة	فائقة الدقة

كروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) وكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء (UPLC) هما شكلا "كروماتوغرافيا السائلة" تستخدم لفصل وتحليل المركبات في خليط. الفرق الرئيسي بين الاثنين هو حجم الجسيمات لمواد تعبئة العمود والضغط المستخدم. يستخدم UPLC حجم جزيئات أصغر (عادة 1.7-2.2 ميكرون) وضغط أعلى (يصل إلى 600 بار) من HPLC (عادة 5 ميكرون وما يصل إلى 400 بار) مما ينتج عنه عمليات فصل أسرع وأكثر كفاءة. تتمتع UPLC أيضًا بدقة أعلى ، مما يسمح بفصل أفضل للمركبات وثيقة الصلة.

تطبيقات HPLC

الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) هي تقنية متعددة الاستخدامات يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من التطبيقات ، بما في ذلك:

التحليل الصيدلاني: يستخدم HPLC لتحليل نقاء وفعالية الأدوية وتحديد الشوائب ومنتجات التحلل.
التحليل البيئي: يستخدم HPLC لتحليل الملوثات في عينات الهواء والماء والتربة.
تحليل الغذاء: يستخدم HPLC لتحليل المضافات الغذائية والمواد الحافظة والفيتامينات والمكونات الأخرى في عينات الطعام.
التحليل السريري: يستخدم HPLC في المختبرات السريرية لتحليل الدم والبول والعينات البيولوجية الأخرى.
تحليل الطب الشرعي: يستخدم HPLC في مختبرات الطب الشرعي لتحليل الأدوية والمواد السامة والأدلة الأخرى.
التحليل الصناعي: يستخدم HPLC في الإعدادات الصناعية لتحليل عينات العملية ، مثل المحفزات ومواد التشحيم والوقود.
الأبحاث الطبية الحيوية: يستخدم HPLC في الأبحاث الطبية الحيوية لتحليل البروتينات والأحماض النووية والجزيئات الحيوية الأخرى.
علم البروتينات والجينوميات: يستخدم HPLC لتنقية وتوصيف البروتينات والحمض النووي.
إنها أداة قوية لفصل وتحديد وقياس مكونات الخليط. باستخدام أنواع مختلفة من الأعمدة وأنظمة الكشف ، يمكن تصميم HPLC لتحليل مجموعة متنوعة من المركبات ، من الجزيئات الصغيرة عالية القطبية إلى الجزيئات الكبيرة غير القطبية.

في الختام، HPLC هي تقنية حساسة للغاية ومتعددة الاستخدامات، يمكن استخدامها على نطاق واسع لفصل وتحليل وتنقية الخلائط المعقدة من المركبات؛ بما في ذلك الأدوية والمبيدات الحشرية والبروتينات. كما يستخدم أيضا في الصناعات الدوائية والغذائية والبيئية، وكذلك في البحث والتطوير. إن تنوع هذه التقنية وحساسيتها تجعلها أداة أساسية في العديد من الصناعات ومجالات البحث.

المصادر

دورق الكيمياء